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    實驗常見問題分析與解決方案
  • 發布日期:2024-10-22     信息來源:      瀏覽次數:1493
    • 上海金鵬分析儀器有限公司針對WB做不好的常見問題分析與解決方案:
      問題可能原因驗證或解決辦法





      背景較高
      封閉不充分延長封閉時間,更換合適的封閉劑(脫脂奶粉,BSA,血清等)
      一抗濃度過高增加一抗稀釋倍數,
      抗體孵育溫度過偏高建議4℃孵育
      二抗非特異性結合
      或與封閉劑交叉反應
      設置二抗對照(不加一抗),降低二抗濃度
      一抗或二抗與封閉劑有交叉反應在孵育和洗滌液中加入Tween-20以減少交叉反應.
      洗膜不充分增加洗滌次數
      膜不合適NC膜比PVDF膜背景低
      膜干燥保證充分的反應液,避免出現干膜現象











      沒有陽性條帶 或很弱

      一抗、二抗等不匹配
      訂購試劑時認真選取一抗與組織種屬, 一抗與二抗或/和底物與酶 系統之間相匹配的抗體及底物。可通過設置內參可以驗證二級檢測 系統的有效性。
      -抗或/和二抗濃度低增加抗體濃度,延長孵育時間
      封閉劑與一抗或二抗有交叉反應封閉時使用溫和的去污劑,如TWEEN20,或更換封閉劑(常用的 脫脂奶、BSA、血清或明膠
      一抗不識別目的物種的靶蛋白檢查說明書,或做ClustalW比對,設陽性對照
      樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過 低(抗原無效)設置陽性對照,如果陽性對照有結果,但標本沒有則可能是標本中 不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標本上樣量至少每孔   20-30ug蛋白,樣本制備時使用蛋白酶抑制劑,或分級提取目的蛋白。
      轉膜不充分,或洗膜過度使用麗春紅S檢測轉膜效果,PVDF膜需浸透,需正確的轉膜操作,勿 過度洗膜
      過度封閉使用含0.5%脫脂奶或無脫脂奶的抗體稀釋液,或更換封閉劑,減少 封閉時間
      一抗失效使用有效期內抗體,分裝保存,避免反復凍融取用,工作液現配現用
      二抗受疊氮鈉抑制所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉(HRP的抑制劑)
      酶和底物失效直接將酶和底物進行混合,如果不顯色則說明酶失活了、選擇在有 效期內、有活性的酶聯物,使用新鮮的底物.
      曝光時間過短延長曝光時間






      多非特異性條 帶
      或條帶位置不 對
      細胞傳代次數過多,使其蛋白表 達模式的分化使用原始或傳代少的細胞株,或平行實驗
      體內表達的蛋白樣本具有多種修 飾形式:乙酰化、磷酸化、甲基 化、烷基化、糖基化等
      查文獻,使用去修飾的試劑使蛋白恢復其正確的大小
      蛋白樣本降解使用新鮮制備的標本,并使用蛋白酶抑制劑
      新蛋白或同族蛋白的分享同種表 位的不同剪接方式查其它文獻報導,或BLAST搜尋,使用說明書報導的細胞株或組織
      一抗濃度過高降低抗體濃度,可以減少非特異性條帶
      二抗濃度過高產生非特異性結合降低抗體濃度,增加二抗對照
      選擇特異性更強,只針對重鏈的二抗
      抗體未純化使用單克隆或親和純化的抗體,減少非特異條帶
      蛋白存在二聚體或多聚體SDS-PAGE電泳上樣前,煮沸10 min,




      以增強蛋白質解聚變性
      背景有白色/黑 色斑點轉膜時有氣泡或抗體分布不均盡量去除氣泡,抗體孵育時保持搖動
      抗體與封閉劑結合過濾封閉劑
      暗片現白條帶一抗或二抗加入過多稀釋抗體的濃度
      目的條帶過低/ 過高SDS-PAGE膠濃度選擇不合適調整膠濃度,分子量大的蛋白用低濃度膠,分子量小的蛋白用高濃 度膠
      “微笑"條帶遷移過快,電泳溫度過高降低電泳速度,低溫電泳(冷室)




      轉膜不充分
      膜沒有完quan均勻濕透使用100%methanol漫透膜
      靶蛋白分子量小于10,000選擇小孔徑的膜,縮短轉移時間
      靶蛋白等電點等于或接近轉移緩 沖液pH值|可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液(pH10.5)或使用低pH值緩 沖液如乙酸緩沖液

      甲醇濃度過高
      過高甲醇濃度會導致蛋白質與SDS分離,從而沉淀在凝膠中,同
      時會使凝膠收縮或變硬,從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇 濃度或者使用乙醇或異丙醇代替
      轉移時間不夠Thick gel對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間



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